高效液相色谱—串联质谱法同时检测鸡肉和鸡蛋中合成类固醇类激素和糖阿尔法激素

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高效液相色谱—串联质谱法同时检测鸡肉和鸡蛋中合成类固醇激素和糖阿尔法激素关键词

  【摘要】建立了鸡肉和鸡蛋中合成Alpha类固醇类激素(睾酮甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙)和糖阿尔法类激素(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松及氢化可的松)多残留的液相色谱串联质谱(LCMS/MS)检测方法。样品经乙腈超声提取,正己烷脱脂净化,以甲醇甲酸水溶液为流动相,经C18柱分离后进行LCMS/MS选择反应监测模式下的定性及定量分析。合成Alpha类固醇类激素采用正离子模式检测,糖阿尔法激素则采用负离子模式检测,正、负离子化模式一次进样同时检测。Alpha类固醇类和糖阿尔法类激素的定量检出限为0.5 μg/kg。在0.5、 1.0和5.0 μg/kg 3种浓度添加水平,上述激素的平均回收率为73.4%~108.9%;相对标准偏差为3.4%~13.4%。可实现样本灵敏、准确地定性定量分析。

  【关键词】 合成Alpha类固醇激素,糖阿尔法激素,多残留分析,液相色谱串联质谱

  1 引言

  激素(hormones)是生物体内产生的一类调节机体代谢或生理功能的微量物质,又称化学信息物。同化激素(anabolic hormones)是残留毒理学意义最重要的药物之一。畜牧业中使用同化激素(非治疗用途)已有近50年的历史,与体育运动中使用违禁药物一同成为药物滥用问题的两个侧面。合成Alpha类固醇激素和糖阿尔法激素都属于甾类同化激素。多数激素类物质具有潜在致癌效应,长期摄入同化激素会导致机体代谢紊乱,发育异常或肿瘤。20世纪80年代以来,许多国家和组织通过立法限制或禁止在食用性动物饲料中使用同化激素[1]。

  目前测定食品中甾体类合成Alpha类固醇激素和糖阿尔法激素残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)[2,3]、气相色谱质谱法(GCMS)[4]和液相色谱质谱法(LCMS/MS)[5~11]。HPLC 方法的灵敏度较低,选择性和特异性差, 已经不适合用于痕量兽药残留分析的要求。GCMS 方法虽然灵敏度和特异性都很高,可以满足残留分析的要求, 但衍生过程繁琐。LCMS/MS是分析动物源性食品中痕量兽药残留的一种重要方法, 该方法灵敏度高, 选择性和特异性好,能够对低浓度的样品进行很好地确认,已用于测定不同基质中的糖阿尔法激素和合成Alpha类固醇激素。由于这两类物质在结构上的差异,还未见将这两类物质在同一方法中一次进样进行分析的报道。

  本研究建立了鸡肉和鸡蛋中睾酮等10种合成Alpha类固醇类激素和泼尼松等7种糖阿尔法激素药物残留的液相色谱串联质谱测定方法。方法采用一次进样,正、负离子化模式同时检测。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  TSQ Quantum Access三重四极杆串联质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司),配置有电喷雾电离源(ESI);Surveyor MS Pump液相色谱系统,包括Surveyor AS自动进样器。

  标准品睾酮、甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙购自Sigma公司。泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松及氢化可的松购自Sigma公司,纯度均大于98%。用甲醇溶解并配制成1.0 g/L标准储备液,再逐级稀释成0.5 mg/L混合标准工作液。其它试剂均为色谱纯。

  标准工作曲线由加入1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L浓度的基质按照样品提取方法处理后定容得6点标准溶液。

  2.2 样品制备

  2.2.1 取样 称取约500 g鸡肌肉组织完全切碎后,匀浆备用。 鸡蛋样品混匀后备用。于-18 ℃冷冻保存。

  2.2.2 提取 称取(5±0.05) g试样于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋30 s,超声提取10 min,加入5 g无水Na2SO4,涡旋,静置10 min,以8000 r/min离心5 min,将上层有机相转移至梨形瓶中。再用10 mL乙腈重复提取一次,合并上层有机相。在40 ℃下,氮气吹干。用0.5 mL甲醇涡旋溶解残渣后再加入0.5 mL水和0.5 mL正己烷。混合溶液涡旋30 s后,以15000 r/min离心5 min,取适量下层溶液经0.22 μm滤膜过滤后,供LCMS/MS法测定。

  2.3 液相色谱及质谱条件

  色谱柱:Thermo Hypersil Gold (100 mm× 2.1 mm, 5 μm);梯度洗脱: 0~1.0 min, 90%A; 1.0~6.0 min, 10%A; 6.0~10.0 min, 10%A; 10.1~12 min, 90%A。其中A为水(0.1%甲酸);B为甲醇;流速:250 μL/min;进样量:25 μL。

  电喷雾电离源(ESI)。合成Alpha类固醇类激素使用正离子模式;选择反应监控(SRM)扫描模式,喷雾电压:4500 V;离子传输管温度:350 ℃;氮气作为鞘气和辅助气,其中鞘气压力为0.060 MPa, 辅助气流量为5 L/min, 碰撞气压力为0.02 MPa。

  糖阿尔法激素类使用负离子模式;选择反应监控(SRM)扫描模式,喷雾电压:3500 V;其余条件同正离子。选择反应监测(SRM)离子对见表1。

  表1 10种合成Alpha类固醇类激素和7种糖阿尔法激素的SRM质谱条件(略)

  Table 1 Parent ions and product ions of compounds in positive ion mode and negative mode

  注(note):下划线碎片离子为定量离子 (the product ions with underline were quantitation ions)。

  3 结果与讨论

  3.1 液相色谱串联质谱分析 这两类激素在质谱响应中,合成Alpha类固醇类采用正离子模式检测;糖阿尔法激素类采用负离子模式检测,在甲酸流动相下,母离子是与甲酸形成的加合离子。通常的做法是正、负离子化模式分开两次进样。在本实验中,一次进样实现正、负离子同时检测。要在质谱分析中实现正负离子同时检测,关键因素就是正确控制正、负离子化模式之间的切换时间。当将所有的正离子设置在同一个扫描窗口(scan event)中,所有的负离子设在另一个扫描窗口中,每个离子之间切换时间很短,在TSQ Quantum Access中为2 ms。正、负离子化模式之间的切换时间为95 ms。在本实验中每个离子的扫描时间为5 ms。完成一次扫描所需要的时间(循环时间,cycle time)是用扫描完全部正离子的25×5+24×2=173 ms,和扫描完全部负离子的21×5+20×2=145 ms,加上正负离子之间两次的切换时间(正→负→正)190 ms。所以完成一次全扫描,色谱峰得到一个信号点的时间是508 ms。如果一个色谱峰峰宽是10 s,该色谱峰就有约19个信号点。

  本实验中,最窄的色谱峰峰宽是9 s,最宽的色谱峰峰宽是18 s,完全能满足色谱峰定量得扫描点要求。所以本实验中可以在一次进样中,同时分析正离子模式检测的合成Alpha类固醇激素和负离子模式检测的糖阿尔法激素。标准的选择离子色谱图如图1所示。

  图1 10种合成Alpha类固醇类激素和7种糖阿尔法激素的LC/MS/MS色谱图(5.0 μg/L)(略)

  Fig.1 LC ESIMS/MS chromatograms of 10 kinds of anabolic Alpha类固醇 hormones and 7 kinds of glucocorticoid hormones(5.0 μg/L)

  由于糖阿尔法激素类药物在电喷雾质谱中的电离形成母离子时存在多种可能[6],有去质子母离子,加甲酸后去质子母离子,去CH2OH母离子。在实验中糖阿尔法激素的母离子选用加甲酸后去质子的母离子,由于在质谱中很容易失去所加的甲酸形成分子离子峰,而且通常分子离子峰的强度均最大,为了确保不出现假阳性检测结果,选择了3个碎片离子进行定性确认。

  3.2 样品提取与净化

  Alpha类固醇类和糖阿尔法类激素的极性都较低,文献报道的方法通常用有机溶剂提取后,固相萃取净化。实验中比较了乙腈、叔丁基甲醚和乙酸乙酯的提取效率。结果表明,提取率相差不大,而乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取后,提取液中脂肪很多,需要进一步去除脂肪。用乙腈提取,提取液中脂肪少,在进一步净化中,只要通过正己烷就可以很好地去除脂肪。

  在提取过程中,如先加入无水Na2SO4,再提取,由于基质中水分较多,样品结块后,会影响提取率。在超声提取后加入无水Na2SO4后需静置10 min。样品提取后,没有进行固相萃取净化,但在液相色谱串联质谱分析中,使用了一个在线切换阀。将色谱柱6.0 min前流出物切换至废液中,不进质谱分析;而6.0~10.0 min时间段流出物进质谱检测器进行分析。这样相当于进行了一次在线的反相固相萃取净化,有效地减少了对质谱检测器的污染。两种基质中,鸡蛋基质相对干净,鸡肉基质的空白和加标图谱如图2和图3所示。从图3中可以看出,在被分析物出峰附近没有干扰峰。

  图2 空白鸡肉基质的LCMS/MS色谱图(略)

  Fig.2 LCMS/MS chromatograms of blank chicken matrix

  图3 鸡肉基质加标1 μg/kg的 LCMS/MS色谱图(略)

  Fig.3 LCMS/MS chromatograms of chicken matrix spiked with 1 μg/kg

  3.3 方法灵敏度(定量限,LOQ)

  方法的检出限是根据响应信号的信噪比来计算。根据标准品的信噪比计算,除了氟氢可的松和群勃龙的灵敏度相对较低,检出限为0.2 μg/kg,其余药物的检出限均可达到0.1 μg/kg甚至更高。完全可以满足药物残留的检测要求。

  通过阴性样品加入法测定,本方法在各鸡肉和鸡蛋中的各种药物的定量限为0.5 μg/kg。方法的线性方程、相关系数、检出限和定量限如表2所示。从结果可以看出,所分析药物的线性相关系数都大于0.99,相关性很好。

  表2 线性方程、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)(略)

  Table 2 Linear equations and the correlation factors, limits of detection (LOD) and limits of quantification(LOQ)

  3.4 方法回收率和精密度

  本方法在鸡肉和鸡蛋中的回收率可达73.4%~108.9%,满足了兽药残留的检出限要求,并且定量、定性准确,重现性好。方法的添加回收率和精密度如表3所示。

  表3 方法添加回收率和精密度(n=6)(略)

  Table 3 Recovery and precision of method (n=6)

  * 化合物序号同表1(the compound No. is the same as table 1)。

  【参考文献】

  1 Li JunSuo(李俊锁),Qiu YueMing(邱月明),Wang Chao(王 超). Analysis of Veterinary Residue(兽药残留分析). Shanghai(上海): Shanghai Science and Technology Press (上海科学技术出版社), 2002: 578~634

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【摘要】建立了鸡肉和鸡蛋中合成类固醇类激素(睾酮、甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙)和糖Alpha类激素(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢

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